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6mA/m6A:同宗同根,黑馬誕生

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6mA/m6A:同宗同根,黑馬誕生

發布日期:2019-11-15 作者:成版人app网站直播 點擊:

表觀遺傳學自提出以來,眾多關於表觀相關的技術日新月異的發展,這些技術也為表觀遺傳學的發展助力。在眾多表觀研究中,甲基化無疑是其中最重要的一環,尤其是DNA甲基化

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▲胚胎發育中DNA甲基化情況

在生命生長發育過程中,會涉及到多種甲基化,DNA甲基化RNA甲基化和蛋白質甲基化。而DNA甲基化前期研究最多的就是5-甲基胞嘧啶(5mC)的修飾類型。

近年來,RNA甲基化也受到眾多科學家的青睞,相關研究報道的文章如雨後春筍般發表。尤其是2018年和2019年的國自然公布結果看,RNA的N-甲基腺嘌呤(m6A)修飾一篇藍海。關於RNA甲基化修飾中涉及到的調控因子也越來越受到關注。熱門關注點要麽關注Writers(METTL3、METTL14和WTAP等),要麽關注Erasers(ALKBH5和FTO),要麽就是Readers(YTHDC1、YTHDF1和YTHDF3等)或者幹脆放棄研究這些調控因子功能,轉而研究與組蛋白甲基化修飾的關聯。

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▲m6A的調控機製

但是與m6A同宗的DNA另一種甲基化修飾N-甲基腺嘌呤(6mA)修飾卻並未如m6A一樣勢如破竹。或者說在真核生物中研究步伐稍顯遲緩。較研究曆史來說,DNA的N6-腺嘌呤甲基化修飾(6mA)比RNA的N6-腺嘌呤甲基化修飾(m6A)更早受到關注,但也僅限於原核生物。究其原因,也許是因為在生物體中的豐度不同造成相關結果。在哺乳動物中,RNA的N6-腺嘌呤甲基化修飾(m6A)的比例為0.1-0.4%,平均每條m6A有3-5個m6A位點;而對於DNA,其表達豐度非常低,在哺乳動物中,平均每百萬個腺嘌呤中隻有不到10個6mA位點。低頻率、低含量的限製造成檢測的困難。但是隨著檢測技術的發展,高靈敏度質譜分析方法成為可能,而高通量測序技術的發展以及低起始量建庫測序技術的革新,6mA的全基因組範圍內研究已經不再受到限製。

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▲6mA調控機製

在真核生物基因組中,有四種不同的6mA分布模式:在綠色藻類中轉錄起始位點(TSS)附近富集;在秀麗線蟲中廣泛分布;在青蛙和老鼠中TSS附近耗盡;在果蠅、斑馬魚和老鼠中重複元素富集。

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而植物中關於m6A的全基因組分布及調控情況研究較少,目前已知的隻有擬南芥和水稻的m6A分布情況稍有報道。

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▲水稻、擬南芥和衣藻全基因組中不同檢測方法檢測的6mA/A水平

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▲水稻全基因組範圍內6mA分布情況

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▲擬南芥全基因組範圍內6mA分布情況

當然,關於DNA的N6-腺嘌呤甲基化修飾(6mA)肯定有很多科學家正在研究或者即將要研究,隨著其在基因組的分布情況及調控因子的發現,關於真核生物中DNA的N6-腺嘌呤甲基化修飾(6mA)的調控機製將會進一步揭示。據目前研究推測6mA在真核生物中作為DNA的5-甲基胞嘧啶甲基化修飾(5mC)的一種補充,其在真核生物的功能將會被進一步為人類所了解,屆時,DNA甲基化研究也將會大邁步向前跨進。

關於DNA的N6-腺嘌呤甲基化修飾(6mA)和RNA的N6-腺嘌呤甲基化修飾(m6A)研究方法大致相同,主要分三步:

第一步:材料的製備

材料的製備可以是通過基因敲除(敲低)或者是不同生長組織(不同細胞、不同組織部位)或者不同生長條件等;

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 ▲不同材料的選取

第二步:6mA或m6A含量的測定

6mA或m6A含量的測定方法有LC-MS/MS 或Dot blot,其檢測流程見下圖。

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▲LC-MS/MS和Dot Blot流程圖

LC-MS/MS 或Dot blot檢測方法的不同點在於LC-MS/MS可以準確定量6mA/A(m6A/A),而Dot Blot隻能大致評估6mA(m6A)水平。

第三步:高通量測序技術

在高通量測序技術中,常規主要是6mA-IP-seq(m6A-IP-seq)和SMRT(Single-molecule real-time sequencing)。

m6A-IP-seq (Methylated RNA immunoprecipitation sequencing)和6mA-IP-seq(DNA N6-methyladenine Immunoprecipitation Sequencing)都是利用特異性抗體富集6mA(m6A)片段,擴增後進行高通量測序及甲基化分析,以較小的數據量,快速地繪製全基因組DNA(RNA)甲基化水平的圖譜。而SMRT(Single-molecule real-time sequencing)也叫作單分子實時測序技術,采用的是對DNA聚合酶的工作狀態進行實時監測的方法,聚合酶合成每一個堿基,都有一個時間段,而當模板堿基帶有修飾時,聚合酶會慢下來,使帶有修飾的堿基兩個相鄰的脈衝峰之間的距離和參考序列的距離之間的比值結果大於1,由此就可以推斷這個位置有修飾。

兩種不同的方法各有優缺點,6mA-IP-seq(m6A-IP-seq)檢測靈敏度高,能捕獲到全基因組的甲基化修飾位點,但是它是非單堿基分布。而SMRT(Single-molecule real-time sequencing)能做到單堿基分布,屬於三代測序範疇,但是其準備性因為讀長較長原因而有所下降。總體來說,兩種方法都可以檢測全基因組範圍內的N6-腺嘌呤甲基化修飾,要怎麽抉擇就看個人選擇了。下圖中展示了兩種不同的測序方法的比較:

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▲SMRT及6mA-IP-seq(兩張不同廠家抗體SYSY和Abcam)分析的6mA的peak重合情況

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▲SMRT測序及6mA-IP-seq(兩張不同廠家抗體SYSY和Abcam)分析的6mA的保守motif情況


值得注意的是,6mA的定量需要嚴格的無菌樣品製備,因為它有被原核DNA汙染的可能性,而在原核DNA中,6mA是普遍存在的,且數量豐富。


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關鍵詞:6mA,m6A,甲基化

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