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蛋白質和RNA互作神器:RIP-seq & CLIP-seq

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蛋白質和RNA互作神器:RIP-seq & CLIP-seq

發布日期:2019-07-26 作者:成版人app网站直播 點擊:


小夥伴都知道小編家的明星產品ChIP-seq,通過免疫共沉澱獲得蛋白互作的DNA;同樣的蛋白和RNA有著千絲萬縷的互作關係,獲得蛋白結合的RNA就需要成版人app网站下载的RIP-seq && CLIP-seq展現魅力了。

簡單來說是通過抗體與靶蛋白進行免疫沉澱反應,將共沉澱下來的RNA分子進行高通量測序。高通量測序作為科研神隊友,結合傳統的免疫沉澱技術,搖身一變就成了現在炙手可熱的熱門技術--RIP-seq && CLIP-seq,接下來看看他們是怎樣合體變身的。

 

  • RNA Immunoprecipitation Sequencing (RIP-seq)

技術簡介

RNA immunoprecipitation sequencing (RIP-seq)RNA免疫共沉澱結合高通量測序的一種技術,通過免疫沉澱靶蛋白來捕獲互作的RNA。將捕獲的RNA進行高通量測序,有助於了解轉錄後調控網絡的動態過程。

 

技術優勢

1. RNA-seq不僅局限於miRNARNA結合蛋白(RBP)的傳統研究,而且能分析RBPlncRNA的互作網絡,幫助向日葵视频APP下载ioses了解lncRNA在的功能;

2. CLIP-seq相比,RIP-seq不需要進行紫外交聯,操作簡單,成功率更高;

3. 覆蓋廣,可在全基因組範圍對蛋白結合位點進行篩選與鑒定;

4. 分辨率高,結合高通量測序技術,可發現新的蛋白結合位點。

 

應用方向

1. 驗證RNA與靶蛋白的相互作用;

2. 在全基因組範圍內鑒定RNARBP的相互作用網絡;

3. 分析RBPmiRNAlncRNA等非編碼RNA的相互作用。

 

 

實驗步驟

組織破碎裂解,提取蛋白和RNA混合物;磁珠、抗體、蛋白和RNA混合物過夜孵育;多次洗滌,除去非特異結合的RNA;解交聯,純化RNA片段;q-PCR或測序分析。

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案例分享: The transcription factor CBFB suppresses breast cancer through orchestrating translation and transcription (Nature Communications ,2019).

CBFB基因編碼的蛋白質是屬於pebp2/cbf轉錄因子家族,該轉錄因子家族主要調控造血(runx1)和成骨(runx2)特異性基因的宿主。β亞單位是一種非DNA結合調節亞單位。CBFB也可與RNA結合發揮調控作用,通過RNA免疫沉澱後的深度測序(RIP-seq)技術, 探究得到CBFB與數百個轉錄本結合,其中CBFB通過hnRNPKmrna結合,並通過eIF4B(一種常見的翻譯起始因子)增強翻譯。核CBFB/RUNX1複合物在乳腺癌中轉錄抑製致癌NOTCH信號通路。此研究為癌症的靶向治療提供新的方向。

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Fig. 1 Genome-wide binding of CBFB and hnRNPK to mRNAs. RIP-seq of FLAG-CBFB

 

  • UV Cross-linking and Immunoprecipitation (CLIP-seq)

技術簡介

紫外交聯免疫沉澱(UV cross-linking and immunoprecipitation, CLIP)用於研究RNA結合蛋白在體內與眾多RNA靶標的結合模式,揭示其生物學功能。主要原理是基於RNA分子與RNA結合蛋白在紫外照射下發生共價結合,提高RNA結合蛋白與相應RNA靶標的結合強度。

 

技術優勢

1. 準確性高:從活細胞交聯開始,反應了體內環境下真實的分子間互作。

2. 特異性強:紫外輻射不會造成蛋白和蛋白之間的交聯,能夠鑒定靶蛋白和RNA 之間的直接相互作用。

3. 應用範圍廣:特別適用於研究剪接因子RNA結合圖譜、miRNA作用靶點等研究。

 

應用方向

1. 驗證RNA與靶蛋白的直接相互作用及精確的結合位點;

2. 在全基因組範圍內鑒定RNARBP的相互作用網絡

3. lncRNA/circRNA功能機製研究以及miRNA靶標鑒定

 

實驗步驟

紫外交聯,組織破碎裂解,利用RNA結合蛋白的特異性抗體將RNA-蛋白質複合體沉澱,回收其中的RNA,並進行高通量測序,再經生物信息學的分析,進而深入揭示RNA結合蛋白與RNA分子的調控作用及其對生命的意義。

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案例分享:Hfq Globally Binds and Destabilizes sRNAs and mRNAs in Yersinia pestis (Molecular Biology and Physiology 2014).

Hfq是細菌中普遍存在的一種Sm-like RNA-binding protein,參與了細菌的生理適應度和發病機製,但其在體內結合機製尚不明確。采用 (CLIP-seq)方法探究得到Y. pestis中全基因組的hfq結合RNA。發現Y. pestisHfq結合80%以上為mRNA,而且Hfq結合非編碼小RNA (sRNAs)MotifAGAAUAAGGGGAUUA。這些結果共同展示了高質量的Hfq-RNAY. pestis中的相互作用圖譜,這對於進一步破譯Hfq-sRNAsY. pestis中的調控作用具有重要意義。

 

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Fig. 2 CLIP-seq revealed that Hfq binds more than 80% of transcribed RNAs in Y. pestis.

 

總結與優勢

近年來,研究人員不僅僅關注於DNARNA序列本身,對於非序列依賴性的表觀遺傳修飾,也會產生更大的興趣;曾經被認為是垃圾DNA的非編碼片序列也引起了研究人員極大的興趣;同時,RNA結合蛋白的功能以及轉錄後的RNA調控網絡也備受關注,為了解決這些問題,滿足大家的科研需求,推出了RIP-seq和進階版的CLIP-seq技術。

OK!今天就跟大家分享到這裏,想了解更多熱點研究、熱門技術、研究動態,歡迎持續關注向日葵视频未成年禁止观看生物,成版人app网站下载下次再見!


本文網址:http://www.chinayuwo.com/news/467.html

關鍵詞:蛋白質,RNA,互作

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