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那些年ChIP-seq遇到的一些坑——第二彈:免疫共沉澱及後續驗證的陷阱

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那些年ChIP-seq遇到的一些坑——第二彈:免疫共沉澱及後續驗證的陷阱

發布日期:2019-07-15 作者:成版人app网站下载 點擊:

之前成年短视频破解APP分享了關於染色質免疫共沉澱測序實驗中染色質的提取及片段化可能遇到的坑(那些年ChIP-seq遇到的一些坑——第一彈:預處理的漩渦),不少小夥伴早已經迫不及待地問小編富集部分及後續實驗環節中還有哪些坑要躲?那麽,成版人app网站下载今天就來看一下免疫共沉澱及後續驗證的陷阱?

Q1:商業化ChIP抗體那麽多,我該如何選擇呢?

A1: ChIP實驗中需要選擇ChIP級別抗體,不同的抗體品牌都有ChIP級別或ChIP-seq級別的抗體,到底我該選擇哪支抗體會更好呢?這裏給大家推薦一個很好的抗體查詢網站CiteAb(http://www.citeab.com/),它不僅可以查詢到該某個體的全部信息,並且還可以獲得ChIP抗體的文獻引用次數,通常文獻引用較多的那個當然是首選的抗體。

Q2:組蛋白修飾的抗體是不是隻要是ChIP級別的就可以了?

A2: 組蛋白通常在生物體內是相對保守的,但也不代表所有的物種都是可以適用的。因為抗體生產都是以哺乳動物為載體的,其中,一些親緣關係較遠的物種可能就不一定合適了。小編接觸過一些此類樣本,如一些家禽、家畜及木本植物在某幾個組蛋白修飾抗體上的保守性上就差一些。如下圖為一個家畜組織的H3K27AC的Western Blot結果(曝光600s)。


01.jpg


Q3: 研究的轉錄因子沒有合適的抗體是不是就不能做ChIP實驗了?

A3:當然不會了,除了已經驗證了的ChIP級別抗體外,也有一些老師選擇退而求其次,選擇IP/IHC/ICC級別的抗體進行嚐試也是一種辦法。因為這些級別的抗體與ChIP抗體一樣識別的是蛋白的Native結構,隻是有些抗體暫時還沒經過ChIP驗證,說不定也能得到較好的結果。除此之外,還有一種方法就是構建融合標簽體係,將標簽蛋白(Flag、His、HA、MYC、GFP)與目的蛋白進行融合表達,利用標簽抗體捕獲,從而獲得標簽抗蛋白-目的蛋白及DNA的信息。或者有些老師自己純化抗原或合成多肽選擇自己製備抗體。這些方法都有可能獲得較好的ChIP-seq結果,但同時有著各自的缺陷。非ChIP級別的抗體或者自製抗體,由於沒有經過驗證,要想得到較好的結果,所以,在抗體用量上通常要進行多次摸索嚐試。標簽抗體也有它自身風險性:首先,是受體的選擇,沒有選擇突變體作為受體而是以野生型作為受體,這樣內源性的蛋白可能會和標簽融合蛋白競爭性結合DNA,導致富集位點變少;其次,對照的選擇,對照材料選擇野生型而不是轉標簽的空載,標簽蛋白可能本身會有與DNA結合的風險,倘若不能以空載為對照,會有假陽性結果;另外,在抗體選擇時,盡量選擇較小分子量的標簽,如Flag、HA、His等,不推薦使用大分子量的標簽蛋白,可能會由於空間阻位幹擾正常的DNA和蛋白結合。

Q4:轉錄因子類的抗體還有特別要注意的地方嗎?

A4:轉錄因子ChIP-seq較組蛋白難做的原因除了其表達豐度較低之外,許多的轉錄因子的表達往往是誘導型表達的,是瞬時表達的,不像組蛋白那麽穩定,因此,在樣本的準備階段就要嚴格檢測。除此之外,關於抗體準備階段有個小細節也應該受到關注,即不同轉錄因子的剪切體的存在。有些轉錄因子在生物體內通常會有不同的剪切體,不同剪切體的表達量也會有差異,而抗體製備過程中抗原的位點設計,不同品牌抗體會有所差異,選擇合適的抗體就變得非常重要了。通過將研究的轉錄因子的序列與抗原位點進行比對即可知道該抗體是否滿足研究需求。

Q5: 免疫沉澱中如何進行微珠的選擇?

A5:磁珠較瓊脂糖微珠有著較強的優勢:更方便快捷的洗滌條件;避免使用封閉的DNA,更適合ChIP-seq;更好的富集度和更低的本底信號。在Protein A、 Protein G、 Protein A/G的選擇上,不同的珠子有各種的優點:Protein A與兔多抗體結合能力強;Protein G:結合範圍較廣;Protein A/G:背景較低;建議在磁珠選擇上選擇Protein A/G磁珠。

Q6: 如何確定ChIP實驗是否成功?

A6:通過實時熒光定量PCR對富集後的產物進行分析是在ChIP-seq之前檢測ChIP實驗是否成功的一種較為有效的方法。首先,確認感興趣蛋白質-DNA相互作用的靶位點基因序列。對於轉錄因子的引物:分析啟動子區域“motif”富集區域(MEME分析工具),在TTS附近100bp-2kb區域內設計多條引物,特別是在100-500bp處;對於陽性引物:任何可能結合的DNA序列;對於陰性引物:凡是不能和蛋白發生互作的DNA(內含子序列,管家基因等)。通過與陰性抗體lgG及陽性和陰性引物的數據的比較,從免疫沉澱效率(Input率)和DNA蛋白結合能力(富集倍率)兩個方麵並結合文獻已知數據來衡量實驗是否成功。

Q7: ChIP-DNA建庫前的質控都有什麽?

A7:DNA的質量、濃度及片段大小在建庫之前都是需要進行考量的,濃度較低或片段過大,對建庫和測序均存在有風險。對於濃度較低的,通常建議進行多次IP後把產物合並。對於片段較大的有些小夥伴們會問,那能不能再將這些大片段進行打斷來滿足建庫呢?NO,NO,NO,這是堅決不允許的!因為二次打斷會增加假陽性率。因此,這就是之前為什麽強調合適片段化的重要性。

    文庫順利建成,終於可以長舒口氣了。看了ChIP-seq路上可能遇到的這些坑,是不是就感覺ChIP-seq想做好真的很不容易了。對了,18岁末成禁止观看的線上課堂本周三會給大家線上分享躲坑秘籍,屆時歡迎大家互相分享經驗噢!


本文網址:http://www.chinayuwo.com/news/464.html

關鍵詞:ChIP-seq,抗體,免疫共沉澱

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